磁珠法质粒DNA提取试剂盒在菌液样本抽提质粒的应用实例见下。

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【手工提取步骤】

1. 取1-5ml过夜培养的菌液加入离心管中，5000g离心1min；

2. 弃上清，收集菌体沉淀；

3. 在离心管中加入100µl溶液I和10µl RNaseA溶液，充分混匀，悬浮菌体沉淀；

4. 加入150µl溶液II，温和上下颠倒混匀4-6次；

5. 向离心管中加入150µl溶液III，立即温和地上下颠倒混匀4-6次（出现大量白色絮状物），或用移液枪吸打混匀，直至溶液澄清，白色絮状物完全析出（如需完全降解

RNA，建议静置10min）；

6. 15,000g离心5分钟；

7. 将步骤6中所得的上清液转移到另一离心管，加入25µl核酸提取磁珠、200µl 结合液，上下颠倒温和混匀1-2min；

8. 用磁分离架吸附磁珠1min，弃上清；

9. 加入800µl 75%乙醇溶液洗涤磁珠两次；

10. 吸附磁珠，弃上清后静置5min，去除乙醇残留；

11. 加入100µl洗脱液，置于室温，混和均匀洗脱5min（56oC洗脱效果更佳）；

12. 磁场吸附磁珠，回收含质粒DNA的洗脱液至另一干净离心管内，进行DNA检测及后续实验。

1、未提出质粒或质粒得率较低，如何解决?

A. 大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

B. 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

C. 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次

接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

D. 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助

于增加质粒提取量和提高质粒质量。

E. 质粒未全部溶解 (尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

F. 乙醇残留：洗涤液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

2、 怎样提取不同体积的菌液？

A．可以同比例调整试剂的用量达到提取不同体积的菌液的目的。

B．对于大体积菌液，建议使用强磁板，可以加速提取过程。